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mRNA体外合成整体解决方案

随着生物科技的发展,生物治疗业已成为重要的前沿疾病治疗技术,其中利用RNA体外合成技术制备的mRNA疫苗在2020年大爆发的COVID-19传染病上产生了巨大的影响。很多公司如美国Moderna、德国CureVac、BioNTech等均已经开展了其他疾病如肿瘤、传染病、慢性病等治疗性mRNA疫苗和药物开发。


   mRNA疫苗


mRNAMessenger RNA或信使RNA)在人类生物学中起着基本作用,它转移存储在DNA中的指令来制活细胞所需的蛋白质。mRNA疫苗是将RNA在体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原,从而导机体产生针对该抗原的免疫应答,进而扩大机体的免疫能力[2,3]mRNA疫苗分为非复制性mRNA(nonreplicating mRNA)和自扩增mRNA(self-amplifying mRNA)两类:自扩增mRNA不仅编码目标抗原,而且还编码能够使细胞内RNA扩增和蛋白表达的复制机制。非复制性mRNA疫苗仅编码目标抗原并包含5′3′非翻译区(UTR),它们提供对适应性和先天免疫力的综合刺激,即原位抗原表达和危险信号传递。

mRNA疫苗开发流程包括病原体识别、测序、mRNA体外合成和修饰、纯化等操作。

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图1. mRNA疫苗的示意图及其抗原表达的机制[4]               

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图2.
mRNA疫苗生产制备流程图[5]



   mRNA体外合成


体外合成RNAIVT)主要是以DNA为模板通过体外转录得到,常用的是以线性化质粒DNAPCR扩增产物为模板利用RNA聚合酶在体外转录合成。主要过程是利用含有T7启动子(TAATACGACTCACTATAGGG)或SP6启动子(ATTTAGGTGACACTATAG)序列的DNA为模板在含有T7SP6 RNA聚合酶的条件下,以NTP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA,简单快速获得大量的mRNA分子,通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。

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图3. 体外转录(IVTmRNA生产和装配过程[6]


世界杯买球网站经过匠心研发开发出的
Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit高产量体外合成试剂盒包含一整套的RNA合成所需试剂,并配有详细的教程。试剂盒可以合成长转录本以及短转录本,以1μg的模板投入量可以产生100-200 μgRNA,适用于单链 RNA合成(包括siRNA等各类RNA前体及RNA探针)和以Cap analog为引物合成Capped mRNA


» 产品特点

 高产量:2h内产生100-200µg,单次放大反应可产生毫克级RNA 

 多功能: 适用于长片段和短片段RNA转录

 灵活性: 可获得无标记、标记以及加帽的RNA


» 测试数据

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  图4. 不同长度转录-时间梯度电泳图

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图5. 不同目的片段的转录产量
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图6. 不同目的片段的转录产物品质


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产品名称

货号

规格

Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit

10623ES50/60

50/100T



   mRNA修饰


由于RNA的稳定性较弱,因此合成后的mRNA稳定性是必须要重点关注的问题。通常需要通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。世界杯买球网站提供低残留和高效加帽的Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)是经过GMP生产获得,完全满足疫苗生产所需,并提供其他相关的酶类和试剂。

» 产品特点

生产工艺:GMP工艺生产

 残留:无核酸酶、内毒素含量低

来源:大肠杆菌重组表达

纯度高:纯度 >95%SDS-PAGE

比活:~160000U/mg(BCA)

»  GMP级别质检

质检项目

蛋白酶

核酸外切酶

切口酶

RNA

内毒素

宿主蛋白

宿主核酸

无菌检测

病原体

支原体


注:具体质检标准及数据参考具体COA,病原体包括HBC/HCV/HIV,其他产品病原体检测均是。


» 加帽效率

质谱测定两种酶的加帽效率,并与对照品的酶加帽效率进行对比,可以发现世界杯买球网站的加帽效率比较高,获得的产物的纯度也较高。


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» 残留检测

分别检测Rnase、核酸酶、切口酶、大肠杆菌DNA残留,经检测结果显示,成品无相关酶的残留,且表达的宿主DNA残留也达到了要求标准。

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产品名称

货号

规格

UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade

10614ES84/92/94

2000/10000/20000U




   mRNA残留去除


合成后的产物可能会有DNA残留,在疫苗开发阶段,残留的去除是关键的步骤,以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。世界杯买球网站开发DNase I是通过原核生物表达并经过GMP工艺生产,满足疫苗开发的需求。


» 产品特点

生产工艺:GMP工艺生产

 残留:无核酸酶、内毒素含量低

来源:大肠杆菌重组表达

纯度高:80% by Biuret

活:≥2000 Kunitz Units/mg protein


»  GMP级别质检

质检项目

蛋白酶

核酸外切酶

切口酶

RNA

内毒素

宿主蛋白

宿主核酸

无菌检测

病原体

支原体


注:具体质检标准及数据参考具体COA


» 测试数据

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图7. RNAse残留检测

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通过SDS-PAGE分析确定的DNase I(无RNase)纯度约为95%

8. DNase I(无RNase)纯度检测(SDS-PAGE

» 相关产品

产品名称

货号

规格

UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade

10611ES76/84

500/2000U



   mRNA纯化


在经历严格的合成及修饰后,所获得的mRNA需要进一步的纯化以达到后续研究的纯度标准。世界杯买球网站开发的mRNA纯化磁珠是偶联了OligodT)的微米级顺磁性微球。运用Oligo(dT)特异结合到mRNAPoly(A)尾端,特异地将mRNA从总RNA中分离出来。


» 产品特点

高效率:mRNA纯化在45min内完成

高纯度:Oligo(dT) 磁珠特异性吸附mRNA

灵活:兼容手动和自动化操作平台

可靠:获得的mRNA适用NGS、体外翻译、RT-PCRCDNA合成


» 纯化效果好

使用磁珠纯化拟南芥和小鼠肝组织RNA样本,Hieff NGS® mRNA Isoaltion BeadsmRNA回收效率更高,rRNA的去除效果更好。

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图9. mRNA Isolation Kit纯化不同RNA样本中的mRNA  管家基因产量表征mRNA回收效果。rRNA相关基因产量表征rRNA去除效果

 

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图10. mRNA 纯化操作流程


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产品

产品名称

货号

规格

Hieff  NGS® mRNA Isolation Master Kit  mRNA 纯化试剂盒

12603ES24 /96

24/96T

世界杯买球网站作为分子酶领域创新领导者,专注为您提供高品质的分子酶产品及相关试剂盒,为您的科学研究和药物及疫苗的开发提供更多选择和方便,也为人类的未来健康事业奉献一份力量。



 其他相关产品



产品名称

货号

规格

UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade

10614ES84/92

2000/10000U

UCF.ME® mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase  GMP-grade

10612ES84/92

2000/10000U

UCF.ME® T7 RNA Polymerase GMP-grade(1 KU/μl)

10613ES92/97

10/50KU

UCF.ME® Murine   RNase inhibitor GMP-grade 

10621ES10/20

10/20   KU

UCF.ME® Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade

10620ES10/60

10/100U

UCF.ME® DNase I , RNase-free ,GMP-grade

10611ES76/84

500/2000U

Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit

10623ES50/60

50/100T

S-adenosylmethionine (SAM)

10619ES02

0.5ml

GTP Solution(100mM) 

10132ES03

1ml

NTP Set Solution(ATP, CTP, UTP, GTP, 100 mM each)

10133ES03

1 Set (4 vial)


1Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.

2】苗鹤凡, 郭勇, 江新香. mRNA疫苗研究进展及挑战[J]. 免疫学杂志, 2016(05):446-449.

3Kramps T., Elbers K. (2017) Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines. Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY.

4Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.

5Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,

6Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,


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